Page 208 - 59. КОНГРЕС СТУДЕНАТА БИОМЕДИЦИНСКИХ НАУКА СРБИЈЕ СА ИНТЕРНАЦИОНАЛНИМ УЧЕШЋЕМ
P. 208
59th SERBIAN STUDENTS’ CONFERENCE OF BIOMEDICAL SCIENCES
April WITH INTERNATIONAL PARTICIPATION
26-30
УТВРЂИВАЊЕ МЕХАНИЗМА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МЕТОТРЕКСАТА IN VITRO
Аутор: Марио Бало
e-mail: balo.mario15@gmail.com
Ментор: доц. др Соња Мисирлић Денчић
Институт за медицинску и клиничку биохемију, Медицински факултет Универзитета у Београду
Увод: Метотрексат (МТТ) се корити као антитуморски лек још од средине прошлог века. Спада у групу антифолата и има
широку примену у терапији разних малигних обољења, укључујући и акутну лимфобластну леукемију. Упркос дугогодишњој
употреби овог лека, и даље нису у потпуности разјашњени сви молекуларни механизми које он покреће у туморским
ћелијама, као ни прецизан механизам којим активира смрт ћелија тумора.
Циљ рада: Циљ овог истраживања је био да утврди механизам цитотоксичног дејства метротрексата in vitro.
Материјал и методе:Коришћене су MOLT-4, ћелијска линија хумане акутне лимфобластне леукемије и MRC-5, ћелијска
линија имортализованих хуманих феталних фибробласта. Вијабилитет ћелија третираних МТТ-ом процењиван је на основу
мерења активности унутарћелијског ензима киселе фосфатазе, а промене у морфологији ћелија детектоване су светлосном
микроскопијом. Механизам ћелијске смрти испитиван је проточном цитометријом бојењем панкаспазним инхибитором
коњугованим флуоресцеин изотиоцијанатом и акридин оранжом за детекцију активних каспаза, односно, киселих везикула.
Резултати: МТT смањује вијабилитет MOLT-4 ћелија након 48 ч, док до изразите активације каспаза доводи већ након 24 ч.
Међутим, не доводи до пораста броја киселих унутарћелијских везикула у MOLT-4 ћелијама. До смањења вијабилитета
MRC-5 ћелија МТТ доводи већ након 24 ч, али након 72 ч вијабилитет је значајно већи у односу на туморске ћелије при
истим експерименталним условима. Код MRC-5 ћелија долази до активације каспаза касније, тј. након 48 ч, али и до
повећања количине киселих унутарћелијских везикула у цитоплазми након 24 ч.
Закључак: МТТ остварује снажнији цитотоксични ефекат на хуманим леукемијским ћелијама у дужем третману (72 ч) у
поређењу са здравим имортализованим хуманим фибробластима. Такође, интензивније и пре активира каспазе у
леукемијским ћелијама и не узрокује закишељавање њихове цитоплазме. МТТ, међутим, доводи до закишељавања
цитоплазме хуманих фибробласта што сугерише активацију аутофагије.
Кључне речи: метотрексат; MOLT-4; MRC-5; апоптоза; аутофагија; акутна лимфобластна леукемија
MECHANISM OF METHOTREXATE’S CYTOTOXICITY, IN VITRO
Author: Mario Balo
e-mail: balo.mario15@gmail.com
Mentor: Assist. Prof.Sonja MisirlicDencic
Institute of Medical and Clinical Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Belgrade
Inroduction: Since mid-twentieth century, methotrexate (MTX) has been used as an antifolate agent in the treatment of various
cancers, including acute lymphoblastic leukemia. Despite being used in clinical practice for such a long time, its underlying
molecular mechanisms of action and cell death induction especially of cancer cells, still haven’t been fully explained.
The Aim: The aim of this study was to determine the mechanisms of methotrexate’s cytotoxicity in vitro.
Material and Methods: We used acute lymphoblastic leukemia (MOLT-4) and human lung fibroblast (MRC-5) cell lines. The viability
of the cells treated with MTX was assessed by measuring the activity of intracellular acid phosphatase, while morphology of the
cells was determined by light microscopy. The mechanisms of cell death were analyzed using flow cytometry of the cells stained
with fluorescein isothiocyanate conjugated pan-caspase inhibitor and acridine orange for the detection of caspase activity and
acidic vesicles cytoplasm content, respectively.
Results: MTX increased caspase activity in MOLT-4 cells after 24 h and decreased their viability after 48 h. But it did not cause the
acidification of MOLT-4 cytoplasm. MTX decreased the viability of MRC-5 cells after 24 h, but after 72 h the viability was
significantly greater than of leukemic cells under the same experimental conditions. The amount of intracellular acidic vesicles
content in MRC-5 cells increased after 24 h and was followed by the increase in caspase activity later on (48 h).
Conclusion: Cytotoxic action of MTX was stronger compared to healthy human fibroblasts after 72 h treatment. MTX led to earlier
and more intensive activation of caspases in leukemic cells than in healthy fibroblasts, while not increasing the amount of acidic
vesicles in MOLT-4 cells. But, MTX led to intracellular acidification of healthy fibroblasts’ cytoplasm which suggests the autophagy
activation.
Keywords: Methotrexate; MOLT-4; MRC-5;Apoptosis; Autophagy; Acute lymphoblastic leukemia
Kopaonik, 2018.
202