Page 44 - 59. КОНГРЕС СТУДЕНАТА БИОМЕДИЦИНСКИХ НАУКА СРБИЈЕ СА ИНТЕРНАЦИОНАЛНИМ УЧЕШЋЕМ

59th SERBIAN STUDENTS’ CONFERENCE OF BIOMEDICAL SCIENCES
April WITH INTERNATIONAL PARTICIPATION
26-30
УТИЦАЈ ФОРМАЛИНА НА СТЕПЕН ФРАГМЕНТАЦИЈЕ МОЛЕКУЛА ДНК У ТКИВУ СРЦА

Аутор: Макуловић Стефан
e-mail: makulovics@yahoo.com
Ментор: доц.др Данијела B. Тодоровић, др Катарина Витошевић
Катедра за Генетику, Факултет медицинских наука Универзитета у Крагујевцу

Увод: Употреба формалина као фиксатива у форензичкој генетици је ограничена, јер формалин формира унакрсне везе са
протеинима и ДНК што доводи до фрагментације молекула ДНК након одређеног времена.
Циљ рада: Циљ овог истраживања је био да се одреди утицај температуре фиксатива и дужине фиксације здравог ткива
срца у пуферизованом и непуферизованом формалину на принос, степен чистоће и степен фрагментације ДНК изоловане
екстракцијом помоћу фенол:хлороформ:изоамил алкохола.
Материјал и методе: За анализу су коришћени исечци здравог ткива срца који су узети у току судскомедицинске обдукције
и фиксирани у формалину на собној температури и светлости и на +4°С у мраку од 24h-7 дана (на сваких 24h), 10, 14 и 28
дана након обдукције. Геномска ДНК је изолована екстракцијом помоћу фенол:хлороформ:изоамил алкохола.
Концентрација геномске ДНК је одређена спектрофотометријским мерењем апсорбанције на 260nm (А260). Чистоћа
узорака је одређена односом апсорбанце нуклеинских киселина и протеина (А260/А280). Степен фрагментације геномске
ДНК је одређен ланчаном реакцијом полимерaзе (duplex PCR). Коришћени су прајмери за 2 гена: GPDH (150bp) и β-aktin
(262bp). Ампликони су анализирани на хоризонталном 2% агарозном гелу у присуству етидијум бромида.
Резултати: Већа концентрација ДНК је добијена из ткива срца фиксираног у формалину на +4°С у мраку. Очуваност молекула
ДНК је боља у ткиву срца фиксираног у непуферизованом формалину на +4°С у мраку што нам потврђује успешна
амплификација оба гена у узорцима ДНК изолованих после 14 дана фиксације. Степен фрагментације ДНК је већи у зорцима
изолованим из ткива фиксираних у пуферизованом формалину: оба гена су успешно амплификована у узорцима ДНК
изолованим из ткива фиксираних на собној температури и у присуству светлости само до 5 дана након фиксације.
Закључак: Концентрација, чистоћа узорака и очуваност молекула ДНК је већа код ткива срца фиксираних
у непуферизованом формалину на +4°С у мраку.
Кључне речи: форензичка генетика; формалин; duplex PCR; гел-електрофореза

THE EFFECT OF FORMALIN FIXATION ON DEGREE OF DNA FRAGMENTATION IN HEART TISSUE

Author: Makulović Stefan
e-mail: makulovics@yahoo.com
Mentor: Assist.Prof. Danijela V. Todorović, TA Katarina Vitošević
Department of Genetics, Faculty of Medical Sciences, University of Kragujevac

Introduction: The usage of formalin-fixed tissues for obtaining DNA for forensic genetic is limited by crosslinking and DNA
fragmentation.
The Aim: The aim of this study was to determine the influence of temperature of fixative and duration of fixation of a healthy heart
tissue in buffered and unbuffered formalin on the yield, purity and the degree of DNA fragmentation.
Material and Methods: The parts of healthy heart tissue were taken during autopsy and fixed in formalin at room temperature and
light, and at +4°C in the dark, 24 hours-7 days (every 24h), 10, 14 and 28 days after autopsy. Genomic DNA was isolated by
extraction with phenol-chloroform-isoamyl alcohol. Concentration of DNA was determined spectrophotometrically by measuring
the absorbance at 260nm (A 260 ). Purity of the samples was determined by the absorbance ratio of nucleic acids and protein
(A 260 /A 280 ). The fragmentation of DNA was determined by the PCR. The primers for the 2 genes: GPDH (150bp) and β-actin (262bp)
were used. Amplicons were analyzed on a 2% horizontal agarose gel in the presence of ethidium bromide.
Results: A higher concentration of DNA was obtained from the heart tissue formalin-fixed at +4°C in the dark. Preservation of DNA
molecules is better in heart tissue fixed in unbuffered formalin at +4°C in the dark, which is confirmed by the successful
amplification of the two genes in samples of DNA isolated after 14 days of fixation. The degree of DNA fragmentation is greater in
samples isolated from tissues fixed in buffered formalin: both genes were successfully amplified in samples of DNA isolated from
the tissue-fixed at room temperature and light only up to 5 days after the fixation.
Conclusion: The concentration, purity and the preservation of samples of DNA molecules is higher in heart tissue fixed in
unbuffered formalin at +4C in the dark.
Keywords: forensic genetics; formalin; duplex PCR; gel electrophoresis

Kopaonik, 2018.
38